Microscopía confocal: principios y aplicaciones
Las pruebas de diagnóstico por la imagen suponen un gran avance para la medicina, ya que permiten observar, total o parcialmente, el interior del organismo.
Esto facilita a los médicos detectar trastornos, determinar la gravedad de las enfermedades y realizar un seguimiento de control tras el diagnóstico.
Además, son indoloras, seguras y no invasivas (no requieren incisiones en la piel ni insertar instrumentos en el organismo), lo que aporta una mayor comodidad a los pacientes.
Algunas de las pruebas de diagnóstico por imagen tradicionales son la ecografía, la resonancia, la radiografía, la TC o las pruebas de contraste.
También hay pruebas más específicas, como la microscopía confocal, cada vez más habitual en especialidades como la dermatología.
¿Qué es la microscopía confocal?
La microscopía confocal es una técnica de diagnóstico por imagen avanzada para observar estructuras celulares a nivel microscópico y en tiempo real.
La técnica analiza muestras y obtiene imágenes 3D de alta resolución usando un microscopio con escaneo de láser y seccionamiento óptico.
A diferencia de la microscopía convencional, la microscopía confocal elimina luz desenfocada (el láser ilumina un único punto seleccionado y elimina todo lo que está fuera del plano focal) lo que permite procesar imágenes más nítidas.
A quién va dirigido: ¿cuándo se utiliza esta técnica?
Su potencial como herramienta de evaluación y diagnóstico ha extendido el uso de la microscopia confocal para la localización de estructuras celulares, incluyendo bacterias e infecciones.
En oftalmología, se emplea en personas con distrofias corneales (como la de Fuchs) para distinguir y clasificar las diferentes infecciones que se dan en la córnea, o para medir densidades de células endoteliales en pacientes propuestos para cirugías refractivas o de cataratas.
En dermatología, se recomienda para evaluar lesiones cutáneas sospechosas y obtener información detallada sobre su morfología celular sin recurrir a procedimientos invasivos como la biopsia, para el seguimiento de pacientes con enfermedades dermatológicas crónicas o para la detección precoz del cáncer de piel.
Principios Básicos
La microscopía confocal forma parte de las llamadas «técnicas de microscopía de luz fluorescente».
Sin embargo, a diferencia estas, en lugar de usar una fuente de luz externa (lámpara de mercurio, xenón o LED) para excitar los electrones de moléculas fluorescentes contenidos en la muestra, emplea un láser.
Puesto que trabaja con iluminación puntual, el láser solo detecta la imagen que aparece en un plano visual.
Esto hace que sea necesario el escaneo de la muestra (scanning) para reconstruir imágenes bidimensionales o tridimensionales.
Los principios básicos de la técnica son:
- Iluminación Láser
La microscopía confocal utiliza un láser para iluminar un solo punto de luz de la muestra. - Pinhole
El pinhole se basa en la captación de imágenes sin lente, como una «cámara oscura». En su lugar, hay una apertura que facilita la entrada de luz y permite la formación de una imagen sobre un material sensible. El pinhole elabora este plano óptico conjugado frente al detector de fluorescencia, eliminando toda la información que está fuera del plano focal. - Detección de fluorescencia
La fluorescencia de las partículas de la muestra se detecta con tubos fotomultiplicadores (PMT) que, como su nombre indica, multiplican la corriente producida por la luz emitida. Esto facilita la detección de fotones individuales y de otras moléculas fluorescentes de interés, incluso cuando se encuentran en cantidades muy bajas. - Escaneo
Puesto que el láser ilumina la muestra punto por punto, para formar una imagen completa es necesario que este se mueva, escaneando diferentes zonas de la muestra y obteniendo múltiples secciones ópticas. Los microscopios confocales más avanzados tienen un sistema de filtros acústico-ópticos sintonizables (AOTF) acoplados a una o más fuentes de luz láser y a un aparato electro óptico, lo que permite analizar varias partículas fluorescentes a la vez.
Aplicaciones de microscopía confocal
La microscopía confocal permite evaluar muestras biológicas vivas, pero también muestras conservadas en parafina, congeladas o fijadas y montadas en laminillas.
Las aplicaciones de esta técnica se extienden a diferentes áreas de diagnóstico e investigación:
Biología Celular
Para la observación de células vivas, incluyendo la dinámica celular y las interacciones moleculares en tiempo real y bajo condiciones fisiológicas y patológicas determinadas. Fundamental en estudios de expresión y coexpresión de proteínas y otro tipo de biomoléculas.
Neurociencia
Para el estudio de procesos celulares enzimáticos, fagocitosis, apoptosis, reacciones de oxidación, pH intracelular o comunicación y unión entre células. Su aplicación es especialmente útil para estudiar la estructura y función de las redes neuronales, tanto en cerebros enteros como en secciones.
Materiales
Para el análisis de la microestructura y las propiedades de diferentes materiales.
Medicina
Para el diagnóstico de enfermedades y el estudio de tejidos en profundidad. Sus aplicaciones se extienden a la dermatología (estudio de queratosis seborreica, angioma, queratosis actínica, melanoma maligno, psoriasis y pénfigo vulgar), la oftalmología (diagnóstico de infecciones de la córnea y evaluación de la vasculatura del limbo, la conjuntiva, la homeostasis celular ocular o la degeneración macular), las enfermedades músculo-esqueléticas (estudio de la osteoartritis), la medicina regenerativa, la reproducción asistida (diagnóstico genético preimplantacional), las patologías infecciosas y parasitarias o la oncología.
Tipos de microscopía confocal
Existen varios tipos de microscopía confocal dependiendo de sus campos de aplicación:
- Microscopía confocal de fluorescencia. Utiliza tintes fluorescentes o proteínas para marcar estructuras o moléculas específicas dentro de la muestra y que emitan luz al ser excitadas por el láser.
- Microscopía confocal de reflectancia. Se basa en el reflejo de luz y se utiliza en muestras no fluorescentes, como piel o tejido, siendo muy habitual en dermatología.
- Microscopía confocal de barrido láser. Proporciona imágenes tridimensionales de alta resolución gracias a su capacidad de corte óptico. Se emplea para estudiar estructuras y procesos celulares en investigación biológica.
- Microscopía raman confocal. Combina la microscopía confocal con la espectroscopia ramana, una técnica que proporciona información sobre la composición química de elementos. Permite estudiar materiales como polímeros y productos farmacéuticos.
La microscopía confocal supone un importante avance para el diagnóstico diferencial, siendo de gran ayuda para tomar decisiones a la hora de prescribir biopsias o cirugías, pero también para el desarrollo de proyectos en tecnología médica y en departamentos de I+D.
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